J Neuroinflammation︱顾小萍课题组揭示星形胶质细胞网络在长时程异氟烷麻醉介导的术后认知功能障碍中的重要作用

撰文︱董瑞，韩玉强

责编︱王思珍

在目前的临床实践和动物模型研究中，全麻药是必不可少的。理想情况下，麻醉药可引起暂时的、可逆的意识和反应活性消失，而不会产生其他的副作用。实际上，麻醉药物对于手术患者的影响可能会持续到手术结束之后。既往研究表明，长时程异氟烷麻醉（5~6h）会导致小鼠学习记忆能力受损，提示长时间吸入异氟烷可导致术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）。POCD是一种由于麻醉或手术因素导致的认知缺陷的临床现象。当手术患者出现POCD时，不仅会导致生活质量的下降，还会加剧疾病的恶化。根据近年来的文献报道[1]，小胶质细胞和星形胶质细胞驱动的神经炎症可能是POCD的主要神经病理学特征。

星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的胶质细胞类型，占成年哺乳动物总脑体积的近一半。作为神经元重要的营养支持细胞类型，可与神经元直接发生动态相互作用，影响神经元的活动和生存。值得注意的是，星形胶质细胞往往是以缝隙连接（gap junctions，GJs）介导的细胞网络发挥对神经元的神经保护作用，而不是以单个细胞的形式“孤军奋战”。星形胶质细胞的GJs主要是由缝隙连接蛋白43（connexin 43 ，Cx43）构成，当Cx43介导的GJs（GJs-Cx43）发生解偶联时，会形成两个半通道，一般认为，半通道的开放与神经炎症密切相关[2]。

一个完整的星形胶质细胞网络是其能够有效发挥营养支持作用的结构基础，网络的解偶联可能会放大哪怕是很小的病理性损伤。例如，缺乏星形胶质细胞网络偶联的小鼠表现出更高的癫痫易感性[3]；在中风的小鼠模型中，敲除星形胶质细胞Cx43的小鼠有更大体积的组织损伤[4]。同样，星形胶质细胞网络的破坏还会扰乱神经元能量代谢，进而损害突触长时程增强[5]。相反地，利用药物增强Cx43介导的星形胶质细胞网络，对中风具有显著的保护作用[6]。综合上述发现，提示稳定星形胶质细胞GJs-Cx43，可作为一个中枢神经疾病的治疗靶点。然而，星形胶质细胞GJs-Cx43在POCD病理生理过程中的作用尚不清楚。靶向干预星形胶质细胞GJs-Cx43是否能够改善长时程异氟烷麻醉介导的小鼠认知功能下降也有待发掘。

2022年3月7日，南京大学医学院附属鼓楼医院的顾小萍教授团队在Journal of Neuroinflammation上发表了题为“Connexin 43 gap junction-mediated astrocytic network reconstruction attenuates isoflurane-induced cognitive dysfunction in mice”的文章，董瑞和韩玉强为论文共同第一作者，顾小萍主任、马正良主任、夏天娇副教授为论文共同通讯作者。研究发现长时程异氟烷麻醉后，小鼠海马组织和小鼠原代星形胶质细胞中形成的GJs明显减少、半通道活性增强、炎症因子水平升高、小鼠表现出明显的认知障碍。用新型GJs-Cx43 增强剂ZP1609治疗后，GJs-Cx43介导的星形胶质细胞网络功能得到增强、神经炎症得到缓解、并改善了长期异氟烷暴露引起的认知功能障碍。

作者对4月龄的C57BL/6小鼠进行了6 h异氟烷麻醉干预。并在长时程异氟烷麻醉后的第1、第3和第7天进行了行为学测试，然后再提取小鼠的海马组织，检测炎症因子IL-1β和IL-6的水平和Cx43的蛋白表达（图1 A）。作者同样对小鼠原代星形胶质细胞进行相同干预，除了检测炎症因子和Cx43蛋白的水平，还通过划痕负载试验评估星形胶质细胞网络的功能状态（图1 B）。此后，给予原代星形胶质细胞和动物GJs功能增强剂ZP1069，检测药物对星形胶质细胞GJs-Cx43、半通道、炎症因子和行为学的影响（图1 C-D）。

图1 试验过程的图解

（图源：Rui Dong et al., J Neuroinflammation, 2022）

首先，作者通过经典的条件恐惧试验和Y迷宫试验检测了长时程异氟烷麻醉对C57BL/6小鼠学习的影响，发现，与未麻醉的对照组相比较，长时程异氟烷麻醉导致了小鼠学习记忆能力在麻醉后第1、3天的显著降低，在第7天恢复（图2 A-F）；ELISA检测结果显示，长时程麻醉后，伴随着小鼠学习记忆能力的显著下降，海马组织中炎症因子IL-1β和IL-6的水平显著升高（图2 G-J）。以上证据表明：长时程异氟烷麻醉能够导致小鼠发生中枢神经炎症和认知功能障碍。

图2 长时程异氟烷麻醉诱导小鼠中枢神经炎症和认知功能障碍

（图源：Rui Dong et al., J Neuroinflammation, 2022） 

缝隙连接蛋白Cx43的表达量与星形胶质细胞网络的功能息息相关。因此作者使用western blotting方法检测麻醉后第1、3、7天海马总Cx43蛋白的表达。与对照组相比，长时程异氟烷麻醉可导致总Cx43蛋白水平降低，但这一结果不具有统计学差异。实际上，形成功能性缝隙连接的Cx43蛋白（GJs-Cx43）具有不溶于1 % Triton X-100的蛋白特性[7]。因此，作者利用这一特性从总Cx43蛋白中单独提取出形成GJs的Cx43蛋白，并发现，长时程异氟烷麻醉后第1和第3天，GJs-Cx43显著降低，而其余形式的Cx43蛋白水平显著增加（图3 A-C）。接着作者进行了Cx43免疫荧光染色，以进一步支持Cx43在小鼠海马组织中的构象变化。与对照组相比，在第1天和第3天，Iso小鼠的GJS-Cx43荧光斑点百分比明显减少（图3 D-I）。这些结果表明：GJs-Cx43介导的星形胶质细胞网络在认知功能障碍小鼠的海马组织中被破坏。

图3 长时程异氟烷麻醉引发小鼠海马区Cx43蛋白表达构象的改变

（图源：Rui Dong et al., J Neuroinflammation, 2022）

为了进一步证实长时程异氟烷麻醉对缝隙连接介导的星形胶质细胞网络的影响，作者运用小鼠原代星形胶质细胞进行了一系列的体外细胞实验。首先，与在体的结果相一致，异氟烷麻醉会导致原代星形胶质细胞GJs-Cx43水平显著降低（图4 A-D）。其次，划痕负载试验结果显示，在异氟烷作用6 h后，原代星形胶质细胞的荧光黄（一种荧光染料）扩散距离显著缩短（图4 F-I），提示长时程异氟烷麻醉显著损害了原代星形胶质细胞的缝隙连接功能。

图4 长时程异氟烷麻醉抑制原代星形胶质细胞GJs-Cx43的表达，损害缝隙连接功能，并引发炎症

（图源：Rui Dong et al., J Neuroinflammation, 2022）

为了对缝隙连接蛋白介导的星形胶质细胞网络进行更深入的了解，作者给予原代星形胶质细胞缝隙连接特异性增强剂ZP1609干预，发现ZP1609增加了GJs-Cx43的表达水平，但对于总Cx43蛋白的表达量没有统计学差异（图5 A-C）。免疫荧光染色进一步显示，ZP1609可以逆转长时程麻醉后GJs-Cx43荧光斑点的减少（图5 D-E）。并且划痕负载试验也表明，给予ZP1609干预后荧光黄扩散距离较麻醉组（非干预组）显著增加（图5 F-H）。

图5 ZP1609促进GJs-Cx43表达，抑制长时程异氟烷麻醉后原代星形胶质细胞的炎症反应

（图源：Rui Dong et al., J Neuroinflammation, 2022）

为了明确长时程异氟烷麻醉在减少GJs-Cx43的同时，对于半通道活性的影响。作者运用EtBr摄取实验评估了不同条件处理后小鼠原代星形胶质细胞的半通道活性。理论上讲，较高的EtBr荧光强度信号表明半通道活性较高[8]。在此，研究结果显示，经6 h异氟烷麻醉处理后的小鼠原代星形胶质细胞的EtBr信号强度显著增强，然而在给予麻醉后星形胶质细胞ZP1609干预后，EtBr荧光强度信号较干预前并没有出现显著变化（图5 I-J）。除此之外，作者还观察到ZP1609在增加星形胶质细胞GJs-Cx43表达的同时，还减少了炎症因子IL-1β和IL-6的水平（图5 K-L）。这些结果表明：长时程异氟烷麻醉可显著降低小鼠原代星形胶质细胞的缝隙连接功能，同时增加了半通道的活性，而给予ZP1609干预，可逆转长时程异氟烷麻醉诱导的星形胶质细胞缝隙连接解偶联。

为了进一步明确重塑Cx43缝隙连接介导的星形胶质细胞网络在异氟烷诱导的认知功能障碍中的潜在作用，作者对长时程异氟烷麻醉后的小鼠给予ZP1609治疗。发现ZP1609可显著增加GJs-Cx43在海马中的表达，但Cx43蛋白的绝对表达量并没有增加（图6 A-E），组织划痕负载实验结果表明，给予ZP1069可逆转长时程麻醉导致的荧光扩散距离的缩短（图6 F-H）。此外，EtBr染色结果显示，麻醉后小鼠海马组织的半通道活性显著增加，此结果与体外试验结果一致，ZP1609并不影响Cx43介导的半通道活性（图6 I-L）。

图6 ZP1609修复星形胶质细胞网络减轻异氟烷诱导的海马炎性反应

（图源：Rui Dong et al., J Neuroinflammation, 2022） 

为了更加直观地观测到长时程异氟烷麻醉对于缝隙连接蛋白的结构变化，作者运用透射电镜技术进行了观察。相较对照组小鼠，长时程异氟烷麻醉组小鼠的海马组织中，星形胶质细胞之间的间隙显著增宽，而给予ZP1609干预后，显著缩短了间隙的距离（图7 A-B）。这些结果同样证明了ZP1609治疗可以缓解长时程异氟烷麻醉导致的星形胶质细胞之间的解偶联。

图7 ZP1609逆转长时程异氟烷麻醉小鼠海马区星形胶质细胞缝隙连接的超微结构改变

而不影响三方突触结构

（图源：Rui Dong et al., J Neuroinflammation, 2022）

星形胶质细胞的末端突起包裹着神经元突触所形成的解剖结构，被称为“三方突触”（tripartite synapses）。一般认为，“三方突触”是星形胶质细胞调节神经元活动的动态处理器[9]。作者观察到，长时程异氟烷麻醉或者ZP1609的干预对于“三方突触”的结构并没有影响（图7 C）。

图8 ZP1609改善长期异氟烷麻醉小鼠的认知功能

（图源：Rui Dong et al., J Neuroinflammation, 2022）

文章最后，为了进一步明确使用ZP1609增加星形胶质细胞GJs-Cx43，恢复星形胶质细胞网络偶联，是否可以改善小鼠长时程异氟烷麻醉导致的认知功能下降，作者对小鼠进行了行为学评估：经过长时程异氟烷麻醉后，小鼠认知功能出现了显著的下降，在给予ZP1609干预后，无论是在条件恐惧试验或者Y迷宫行为学检测中，其认知功能都得到了显著的改善（图8 A-F）。

图9 工作总结图：星形胶质网络在长时程异氟烷麻醉介导的认知功能下降的假说机制图

（图源：Rui Dong et al., J Neuroinflammation, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

首先，该研究结合分子生物学、细胞学、动物行为学和电子显微镜等多种研究手段，明确了缝隙连接蛋白Cx43介导的星形胶质细胞网络与长时程异氟烷麻醉介导的认知功能下降之间的关系（图9）。长时程异氟烷麻醉降低小鼠海马区GJs-Cx43的表达，继而引发星形细胞网络的解偶联，触发或加剧神经炎症的爆发，最终导致小鼠的认知功能障碍。当运用缝隙连接功能增强剂ZP1609重塑受损的星形胶质细胞网络时，可以减缓神经炎症，并改善认知功能。

从目前已发表的研究结果来看，缝隙连接介导的星形细胞网络可能是一把双刃剑。例如，从新陈代谢的角度来讲，通过缝隙连接网络重新分配资源似乎具有神经保护作用[10]；从缓冲的角度来讲，该网络允许星形胶质细胞更有效地调节内环境稳态[11]。然而，由于缝隙连接的通透非选择性，它们也有可能将有害信号扩散至邻近的细胞，从而放大病理损伤程度[12]。因此，考虑到星形胶质细胞网络的双重效应，在将该研究结果拓展到其他疾病模型中时，应该保持谨慎的态度。

当然本研究还有一些不足之处。首先，高龄是公认的术后认知功能障碍（POCD）发生的高危因素，而该研究并未采用老年鼠，因此，在未来相关的研究中，应考虑在老年鼠上进行。其次，虽然作者发现在长时程异氟烷麻醉的第7天，小鼠的认知功能和Cx43构象与对照组相比不存在统计学差异，但是GJs和半通道的活性仍有待进一步研究。最后，星形胶质细胞网络具有一定的脑区特异性，尽管海马是POCD发生发展的重要脑区，但其他脑区星形胶质细胞网络的变化与POCD的关系也有待进一步阐明。

原文链接：https://doi.org/10.1186/s12974-022-02424-y

第一作者董瑞（上左）、韩玉强（上右）；通讯作者顾小萍（下左）、夏天娇（下中）、马正良（下右）

（照片提供自：南京大学医学院附属鼓楼医院顾小萍研究团队）

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1.Subramaniyan, S. and N. Terrando, Neuroinflammation and Perioperative Neurocognitive Disorders. Anesth Analg, 2019. 128(4): p. 781-788.

2.Xing, L., et al., Connexin Hemichannels in Astrocytes: Role in CNS Disorders. Front Mol Neurosci, 2019. 12: p. 23.

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4.Siushansian, R., et al., Connexin43 null mutation increases infarct size after stroke. J Comp Neurol, 2001. 440(4): p. 387-94.

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10.Cooper, M.L., et al., Redistribution of metabolic resources through astrocyte networks mitigates neurodegenerative stress. Proc Natl Acad Sci U S A, 2020. 117(31): p. 18810-18821.

11.Retamal, M.A., et al., S-nitrosylation and permeation through connexin 43 hemichannels in astrocytes: induction by oxidant stress and reversal by reducing agents. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(12): p. 4475-80.

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制版︱王思珍

本文完